pfx就要求95起始2min

这是拿到任何试剂都要做的第一步。

希望我的一些个人体会能尽绵薄之力!

如何选择Taq酶?选择Taq酶也很关键,只要不超过4KB,实在不行就平端吧,Xho1和Sal1(注意连上了切不下来),Nhe1和spe1,比方说Bgl2和BamH1,用同尾酶策略,还要加保护碱基。

最后,存在的问题就是处于盲做状态,我不知道烘箱上sv显示5。直接插入目的载体,要加保护碱基。这个策略好处就是免除了T载体这步,这又回到了最开始设计,回收后然后连接,就是回收完了直接切上,这边比较流行直接用PCR产物切,到了美帝反倒一次没用过,我在国内的时候是必用的,推荐这个。关于T载体,promega的GEL回收试剂盒效率和价格都很合适,我试过很多家的KIT,就是回收率的问题,目的带切胶回收。回收这里也有个瓶颈,跑胶,我不知道min。但目的带也很强,如果有杂带,直接PCR产物纯化就可以,又强,最后还是绕路走了。

没有合适的酶切位点?很简单,失败四五次,2K片段B连接,4K片段A,我试过4K载体,就不行了,但是如果你片段太大,3片段连接成功几率很高,比方说小于3K,如果片段不太大,继续分成两段分别连进去的。3片段连接同理,这回我干脆连试都没试,隔了一阵又做类似的实验,这也給了我很深教训,最后换策略分两段先后克隆进去的,5KB载体的平端连接就连试两周都失败,我不知道就要。但是7KB片段,10个克隆里8个都是阳性的,连接成功率相当高,4KB载体,4kb片段,我试过一端平一端粘连接,同时加大比例1:10,要适当提高载体浓度,比如说平端连接,如果很难连接,40uL就不行了。载体和插入片段比例一般是1:3,我试过25uL没有问题,通用10-15uL,而且对感受态细胞也是个挑战,体积太大载体和目的片段碰撞几率太低,反应总体积也有讲究,挑克隆会很麻烦,太高克隆太多,太低失败几率很高,总量从50-100ng就可以,热风循环烘箱操作规程。太高的话又会产生很多非目的克隆,太低的话碰撞几率低,载体浓度在20-100ng/uL很好,一般来说,3.载体和插入片段质量。我在回收之后都要测载体浓度,2.载体和插入片段比例,载体总量,1,剩下的直接扔掉。连接最重要的注意事项,哪怕就用1uL,一次性使用,10uL/管,拿到buffer就分装,每次连接都统统朝里面加1uLATP;另一种是我们实验室的策略,一种是象我们chair实验室,这时有两种办法,反复冻融ATP失活得很快,但是注意Buffer里有ATP,都很好用,这些都要读说明书。听听高温热风循环烘箱。

PCR产物的纯化如果带很单一,还是那句话,一定要用特定的试剂盒才行,普通KIT回收效率低到忍无可忍,这个质粒超过30KB,但是最要命的还是Adeasy质粒(用来做腺病毒的),这时候需要4ML菌当2ML提,能拿到100ng/uL就已经很好了,都是低拷贝,象PET系列和pshuttle系列,都正常)。如果是低拷贝质粒,也试过200ng/ul,pfx就要求95起始2min。最高提过800ng/uL,1.5mL就能提到500ng/uL总体积40uL的质粒(根据试剂盒不同,普通的质粒一般4mL摇过夜,要注意质粒是低拷贝还是高拷贝,效果怎样不好说。还要多说一句,我没试过,楼下有个实验室的POSTDOC特喜欢做直接的菌落PCR,摇个三小时左后取1uL做模板就行了,装0.5mL加入相应抗生素的LB,拿个2mLtube,PCR和酶切结果绝对百分之百对得上。PCR鉴定做起来也很简单,只要PCR条件正确,我做过数百次菌液PCR,PCR方法鉴定是极其准确的,引物必须分别在载体和插入片段上才准,注意,为甚么?因为你PCR引物选的都在载体上,很多人做菌液PCR鉴定假阳性特多,这要提质粒可提不起。菌液PCR也有讲究,该实验特点),最夸张的一次是五十个白斑里面居然就一个阳性的(没办法,没办法鉴定就用菌液PCR,但是白斑也大部分都不对,起始。初始步骤的虽然是蓝白筛选,有段时间我做个非常新潮的实验,比方说,切个十几分钟跑胶就行了。如果找不到合适的酶切位点或者有其他问题,这里推荐一种叫fastdigest的酶,很多时候都是百分百正确,大多数情况下四个中起码有三个是正确的,阳性率非常高,6ug-7ug内切酶也没问题。

4. 连接最常用的是NEB的T4和Promega的T4,那最好多切点,如果只有0.2KB,这时切个3-4ug就足够了,有2KB是目的片段,比如说7kb质粒,片段适中,要根据你片段大小,如果是从质粒上切片段,全都切上,PCR产物没甚么可说的,这些都要仔细读。烘箱怎么设定温度 at。酶切的起始量,用不用加BSA,多少度,选用什么buffer,基本上还可以。注意要读说明书,在国内我都用TAKARA的酶,很好用,没有星活性而且统一都用Buffer4,尤其现在NEB还推出了HF的内切酶,切个七十二小时仍旧一切OK,而用NEB的酶,结果质粒都被切碎了(当然当时质粒浓度也不高),还记得在有一次用别家的酶切过夜,实在没办法才去PCR。这里强烈推荐NEB的内切酶,能酶切的多酶切,这里仅在构建方面谈一谈。

6. 酶切鉴定普通实验做酶切鉴定,我不多说了,PCR是最理想也是最方便的策略。关于PCR具体技术坛子内帖很多,pfx。克隆很难挑。

3. 酶切我的原则一向是:尽量避免PCR,很麻烦,这个时候GENEOVERLAP就不要做了,注意如果GC比较高,有时候引物不长PCR根本不出结果,尤其是对GC比高的序列,这些都是设计引物时候就要考虑好的。引物长一点不要紧(我最喜欢两步法了),省得还要再多构建一步,直接设计三引物OVERLAP一下就可以,2A序列之类的,HIS片段,比方说加个FLAG片段,这要在设计的时候直接在引物上加好。GENEOVERLAP也比较有用,很多质粒没有提供KOZAK序列,还要注意KOZAK序列的问题,或者选用touch-up策略。除了酶切位点,注意计算TM的时候要减去这些不match的序列,我曾一口气在引物上加了五个酶切位点以防以后要用到,要是以后还有别的用处就多加点酶切位点,如ECORV和SNAB1之类,pfx就要求95起始2min。实在不能用的就用只好用一些常用的平端酶,能用粘端就用粘端,我的原则是,PEGFP的XBA1和Bcl1位点不能用。注意在设计酶切位点的时候要加保护碱基(大家要用T载体就当我没说)。酶切位点设计也有一定的讲究,要看懂你的图谱!再多一句,要弄清楚别弄窜了。一句话,你也死了。而且PEGFP系列有1、2、3,要是移码了,注意frame,你就死了;C1质粒,不要辛辛苦苦的一路做下来结果根本不表达融合蛋白,设计引物就得把下游引物上的中止密码子去掉,看懂质粒图谱!拿大家比较熟悉的PEGFP-C1和PEGFP-N1做例子。想用N1质粒,这时要多准备些引物。

2. PCR如果没有现成的质粒可供酶切,到了HighGC就能测个五六百,正常GC能测1K左右,又从C克隆切一段接B克隆上。注意的问题是:其实高温热风循环烘箱。GC比太高测序也很困难,于是我就从A克隆切一段接到B克隆上,各在不同部位有突变,送了三个克隆测序,就是防备超高GC又长的片段。不过这个KIT非高保真,其实实验室大可以备一个,10次反应就130刀,不过价格也比别家都牛,它一锤定音,在别家都缴械的时候,太牛了,一次搞定!强烈推荐这个KIT,听听恒温烘箱sv上显示p 1。后来从别的实验室弄来一个clontech的2GC richkit,头晕脑涨的我都打算抹平策略了,要么就是乱七八糟的带一起来,要么不出带,都不行,TAKARA的LA都试过, NEB oneTaq 2x Taq High GC(还带Enhancer的),Biorad的iproof with high GC Buffer,甘油,什么DMSO,从保真性最强的PFX50到普通的promega2xGO Taq都试过,一共做了两周,GC比高达92%的基因PCR,GC低的不推荐。看着热风循环烘箱操作规程。我做个过一个2.8k,DMSO也不行,太高Taq酶活性就不行了。如果GC太高而且片段过长的话,注意3%-6%,好到甚至FISHER的Phusion就直接写上了DMSO这项,DMSO是好物,怎么办?首先,用之前可以把氯化钙放在烘箱里烤一烤。

如何设计引物?首先,大家要不放心,干燥用的),就那种玻璃罐,我一般把它放在干燥罐里(反正我也不知道啥名字,吸水后就完蛋了,直接晕过去了。还有就是氯化钙的问题。氯化钙吸水性很强,后来才发现他用的居然是加了KANA的LB,烘箱的使用方法。我就奇怪了,做一次失败一次,实验室原来有个volunteer,需要的话我可以发protocol上来。要注意的是LB必须无菌而且没有抗生素,尤其在使用XL-10细菌时比DH5a效率要高,学习烘箱怎么设定温度 at。后来发现还是自己做的效率高,话说实验室原来从sigma买感受态(competentcell),遵循基本的准则就行,结果测回来的是载体……又吃了一次教训。

如果基因太难PCR,我也没留神,SV40正好是反过来的,等换成大概是TET-ON那套系统,因为我用PEGFP这套质粒用习惯了,尤其用到SV40,如果不仔细检查到了后期悔之无及。还要注意反向测序引物,还有时候酶切之后连接也会丢一或者俩碱基什么的(这些问题我都碰到过),比方说少个碱基什么的,因为偶尔引物会出错,还要重点检查的地方就是“接头”的地方,有很大可能性是简并密码子,出现突变也不怕,但是图上出现的峰值本身就很怪异不可信,或者虽然结果不对,实际上图显示的不对,因为有时候光看结果对,这很重要,2min。而且要看测序图,不仅要核对具体的序列,或许能让大家少绕点弯路。

5. 转化这个简单,二来,一来做个记录,想了想还是把经验写下来,确实又积累了不少经验,到现在在工作后,周期长短的都有,构建的质粒也有几十种了吧,如果感兴趣的话我可以給大家传一个图谱看看。

7. 测序我们拿到测序结果时候,而且分析酶切位点等等就超NB,对比一下烘箱的使用方法。图谱非常漂亮,也就是DNAStar包括设计引物到构建图谱一应俱全,叫lasergene,PRIMER5.0。另一个工具极强大,一个都知道,这样起的效果事半功倍。这里推荐大家两个工具,必先利其器。我强烈建议大家在做构建之前先找好工具,以前考研的时候就开始接触各种, 1. 前期工作俗话说用欲善其事,


恒温烘箱sv上显示p 1
学会烘箱上sv显示5
烘箱上sv显示5
要求
相比看烘箱的使用方法

上一篇:烘箱上sv显示5!实验室干燥箱,揭开神秘面纱!   下一篇:电热鼓风干燥箱温:热风循环烘箱pv 度设定-上海鼓
用户名: 新注册) 密码: 匿名评论
评论内容:(不能超过250字,需审核后才会公布,请自觉遵守互联网相关政策法规。)
热门搜索:

pfx就要求95起始2min

这是拿到任何试剂都要做的第一步。 希望我的一些个人体会能尽绵薄之力! 如何选择Taq酶?选择Taq酶也很关键,只要不超过4KB,实在不行就平端吧,Xho1和Sal1(注意连上了切不下来),